Bitki Doku Kültürü ve Ökaryotik Hücrelere Gen Aktarımı

Konu Anlatımı

Ne Öğreneceğiz?

Bu konuda iki başlığı birlikte ele alacağız: bitki doku kültürü ile canlı bitki hücresinin uygun bir ortamda yeniden çoğaltılması ve ökaryotik hücrelere gen aktarımı ile yabancı genin bitki genomuna yerleştirilmesi. İkisi aynı laboratuvar mantığını paylaşır: hücre, besin ortamı ve gen aktarımı. Bitki doku kültürü, bitkinin çok küçük bir doku parçasından binlerce yeni bitki üretmeyi mümkün kılar; gen aktarımı ise bu üretim sırasında bitkiye istendiği özellik kazandırır.

Ön Bilgi: Bitki Hücresinin Potansiyeli

Bir bitki hücresi elverişli koşullar sağlandığında bölünüp yeni hücreler üretebilir. Bu yetenek, her hücrenin bütün bir bireyi oluşturabilme potansiyeli olan totipotens ile açıklanır. Doku kültüründe hücrenin kalıtsal bilgisi değiştirilmez; yalnızca hücrenin hangi yönde farklılaşacağı kullanılan ortamla belirlenir. Bu yüzden doku kültüründe çoğaltılan bitkiler, ana bitkiyle aynı genetik yapıyı taşır.

Bitki hücresi ökaryotik bir hücredir; zarlı organelleri ve çekirdeği vardır. Yüksek yapılı bitkilerde sentriyol bulunmadığı için iğ iplikleri, kromozomun sentromer bölgesinden doğrudan oluşur. Bölünme sırasında kardeş kromatitler bu bölgede birbirine bağlı kalır ve kromozomlar hücrenin iki kutbuna çekilir. Mayoz bölünmede ise homolog kromozomlar profaz I evresinde yan yana gelir; krossing-over ile kardeş kromatitler arasında parça değişimi gerçekleşir.

Besin Ortamının Bileşenleri

Bitki doku kültüründe kullanılan besin ortamı beş ana bileşenden oluşur:

• Su: bütün maddelerin çözündüğü ve hücrenin yaşam ortamıdır.
• Makro elementler: azot, fosfor, potasyum, kalsiyum, magnezyum ve kükürt gibi toprakla alınan elementlerdir.
• Mikro elementler: demir, çinko, mangan, bor, bakır ve molibden gibi çok az miktarda da olsa gerekli elementlerdir.
• Organik maddeler: karbon kaynağı olarak sükroz ile buna ek olarak vitaminler ve amino asitler.
• Büyüme düzenleyicileri ve agar: oksin ve sitokinin gibi hormon benzeri maddeler ile ortamı katılaştıran agar.

Ortamın pH değeri genellikle 5,6 ile 5,8 aralığında tutulur. Bu değer aralığında besin elementlerinin alınabilirliği ve tuzların çözünürlüğü korunur; pH değiştiğinde hangi elementin ne kadar alınabileceği de değişir. Agar ise yalnızca ortamı katılaştırır, suyu kolayca geçirdiği için hücrenin besine ve oksijene ulaşmasını engellemez.

Basit Örnek: Kallus ve Organogenez

Doku kültürüne alınan bitki parçasına ekzplant denir. Ekzplanttaki hücreler uygun ortamda dediferansiye geçirir; yani özelleşmiş yapılarını kaybedip hızlı bölünen, farklılaşmamış hücrelere dönüşür. Bu hücrelerin oluşturduğu yığın kallus olarak adlandırılır. Kallus hücreleri belirgin bir işlev özelliği taşımaz, yalnızca çoğalır.

Kallustaki hücrelerin gelişim yönünü oksin ve sitokinin oranı belirler: oksin sitokininden fazla olduğunda kök, sitokinin oksinden fazla olduğunda sürgün oluşur. Kallustan sürgün ya da kök gibi organların yeniden oluşmasına organogenez denir. Bu bilgi sınavda hangi oranın hangi organı oluşturduğu biçiminde sorulur ve iki hormonun rolünün ters çevrilmesi sık görülen bir hatadır.

İleri Örnek: Protoplastlar ve Somakoz

Hücre duvarı, protoplast adı verilen çıplak hücrenin önündeki en büyük engeldir. Hücre duvarı selülaz ve pektinaz enzimleriyle eritilir ve geriye yalnızca hücre zarıyla çevrili protoplast kalır. Protoplastlar, PEG (polietilenglikol) ya da elektrofüzyon yoluyla birbirine kaynaştırılabilir. İki bitki türünün protoplastlarının birleştirilmesiyle oluşan bitkiye somakoz denir.

Somakoz oluşumunda birleşen iki hücrenin kromozom setleri aynı çekirdekte toplanır. Kaynaşan zarlar onarıldıktan sonra hücre duvarının oluşması gerekir; bu onarım gerçekleşmezse hücre bölünmeden ölebilir. Somakoz üretimi, eşeyli üremeden farklı olarak ana ve baba bitkilerinin kalıtsal bilgisini tek hücrede birleştirir.

Adım Adım: Ökaryotik Hücrelere Gen Aktarımı

Ökaryotik hücrelere yabancı gen aktarımında üç temel yöntem kullanılır:

1. Agrobacterium tumefaciens yöntemi: Bu bakterinin Ti plazmidi, bitki hücresine aktarılacak olan T-DNA bölgesini taşır. Araştırmacı T-DNA bölgesini istenen yabancı genle değiştirir; bakteri bu bölgeyi bitki hücresine aktarır ve yabancı gen bitki kromozomuna yerleşir. İkili vektör sisteminde yabancı geni taşıyan vektör ile virülans genlerini taşıyan yardımcı plazmid birbirinden ayrı tutulur.
2. Biyolistik yöntem: DNA, çapı yaklaşık bir mikrometre olan altın veya tungsten parçacıkların üzerine yüklenir ve yüksek basınçlı gazla dokuya fırlatılır. Hücre duvarı olmayan protoplastlarda da uygulanabilir.
3. Elektroporasyon ve PEG yöntemi: Elektroporasyonda elektrik alanı zarda geçici delikler açar; PEG ise zarları geçirgenleştirerek hücreleri kaynaştırır. Bu yöntemlerde dışarıdan verilen DNA'nın hücre içine girmesi sağlanır.

Aktarımın başarılı olup olmadığı ortama seçici (işaret) geni eklenerek sınanır. Örneğin bir antibiyotiğe direnç geni taşıyan bit, ortamda dirençli olmayanlar öldüğü için yalnızca geni almış hücreler seçilebilir hâle gelir. Moleküler düzeyde doğrulama PCR ve dizi analizi ile yapılır; genin ifade edilip edilmediği ise raportör genlerle izlenir.

Kalem ve Anaç: Aşılama ile Doku Kültürünün Bütünleşmesi

Bitki çoğaltımında kalem ve anaç kavramları aşılama yönteminde kullanılır. Kalem, anaç üzerine yerleştirilen üst bitki kısmıdır ve bitkinin toprak üstü organlarını oluşturur. Anaç ise toprakta kalan gövde ve kök kısmıdır; bitkinin besin alımından ve dayanıklılığından sorumludur. Aşılama, kalemin kesik yüzeyiyle anacın kesik yüzeyinin hizalı biçimde birleştirilmesidir.

Doku kültürüyle üretilen kalemlerin anacıyla örtü altında birleştirilmesi, yani in vitro aşılama, araştırma düzeyinde uygulanmaktadır. Bu yöntemde kalem ile anaç arasındaki uyum araştırılır; aşı uyumsuzluğu varsa birleşme gerçekleşmez ve bitki gelişemez. Bu nedenle kalem seçimi, doku kültürünün pratik uygulamalarından biridir.

Kavram Karşılaştırma Tablosu

Sık Yapılan Hatalar

1. Hormon rollerini ters çevirmek: Oksin artışı sürgünü değil kök oluşumunu destekler. Hangi oranın hangi organı verdiği sorusunda bu yön sık ters kurulur.

2. Sentriyol bulunmadığını unutmak: Yüksek yapılı bitki hücresinde sentriyol yoktur; iğ iplikleri kromozomun sentromer bölgesinden oluşur. Bu hücre hayvan hücresiyle karıştırılmamalıdır.

3. n ile 2n ilişkisini karıştırmak: 2n, diploit hücrenin kromozom sayısıdır; n ise gamet ve yavut hücrelerindeki tek set sayısıdır. 2n = 24 olan bir hücrede n = 12 olur.

4. Homolog kromozom ile kardeş kromatiti karıştırmak: Homolog kromozomlar farklı ebeveynlerden gelen kromozomlardır; kardeş kromatitler ise tek bir kromozomun kopyalarıdır. Krossing-over, mayoz I'de homolog kromozomlar arasında gerçekleşir.

5. Besin ortamının görevlerini karıştırmak: Agar yalnızca ortamı katılaştırır, sükroz karbon kaynağıdır; pH değerini ise besin elementlerinin alınabilirliği belirler.

Sınav Odaklı Ek Not

Soru tipi 1 - Hormon oranı sorusu: Önce oksin ile sitokinin oranını yaz, sonra hangi organın oluşacağını söyle. Oksin fazlaysa kök, sitokinin fazlaysa sürgün oluşur.

Soru tipi 2 - n ve 2n hesabı: Soruda verilen sayı 2n ise önce ikiye bölerek n değerini bul; n verilmişse çiftleyerek 2n değerini bul. Kromozom sayısı ile kromatit sayısını ayrı ayrı yaz.

Soru tipi 3 - Yöntem karşılaştırması: Gen aktarımı yöntemlerinde hangi aracın kullanıldığına bak; T-DNA ve Ti plazmidi Agrobacterium yöntemine, metal parçacık biyolistik yönteme aittir.

Soru tipi 4 - Kromozom yapısı sorusu: Sentromer kardeş kromatitleri bir arada tutar, sentriyol iğ ipliklerini düzenler. Bu ikisini karıştıran şıklar elenir.

Özet ve Kendini Dene

Bitki doku kültürü, bitki hücresinin uygun besin ortamında bölünüp organ oluşturmasını sağlar. Ortamda su, mineral tuzlar, sükroz, oksin ve sitokinin ile agar bulunur ve pH 5,6 ile 5,8 arasında tutulur. Farklılaşmamış hücre yığını kallus, bu yığından organ oluşması ise organogenez olarak adlandırılır. Protoplastlar selülaz ve pektinaz ile elde edilir, PEG ile birleştirilir ve somakoz bitkisi oluşturur. Ökaryotik hücrelere gen aktarımı Agrobacterium, biyolistik, elektroporasyon ve PEG yöntemleriyle yapılır; başarı seçici genler ve PCR ile doğrulanır.

Kendini dene: Bitki hücresinde iğ ipliklerinin oluşum yerini insan hücresiyle karşılaştırarak açıkla. Oksin ve sitokinin oranı değiştiğinde hangi organın oluşacağını tahmin et. Verilen 2n = 36 değerinden n değerini hesapla.